結(jié)直腸癌是第三大常見的癌癥。據(jù)估計到2040年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率可能會增加多達(dá)63%。結(jié)直腸癌目前的整體五年生存率為63%，明確原發(fā)灶的早期診斷可以將生存率提高到91%。而晚期病例則會降至12-14%。通常，結(jié)直腸癌起源于大腸上皮細(xì)胞中的遺傳和表觀遺傳改變，這些改變在致癌和癌癥進展中扮演著關(guān)鍵角色。在結(jié)直腸癌中，DNA甲基化是最重要的表觀遺傳改變，抑制基因的啟動子區(qū)，導(dǎo)致它們的失活，并可能導(dǎo)致無控制的細(xì)胞增殖。

目前有研究標(biāo)明，分泌型卷曲相關(guān)蛋白2（SFRP2）可能是結(jié)直腸癌的潛在生物標(biāo)志物。然而，其診斷作用仍然不明確。在本研究中，探討了一隊列結(jié)直腸癌患者的血、脂肪和結(jié)直腸組織樣本中SFRP2甲基化水平的意義，從而識別其作為新的生物標(biāo)志物的效用。

方法學(xué)

本文通過qPCR分析了健康參與者和結(jié)直腸癌患者的SFRP2基因的表達(dá)情況，并用450 K DNA陣列和DNA測序來了解其甲基化狀態(tài)，并評估其作為結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的潛力。此外，還調(diào)查了重組人SFRP2（rhSFRP2）作為治療靶點對細(xì)胞增殖、遷移以及與癌癥發(fā)生和Wnt通路相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。

結(jié)論

在結(jié)直腸癌患者的全血中，SFRP2的甲基化可以預(yù)測腫瘤的臨床階段（I+II vs. III+IV）（曲線下面積=0.653），淋巴結(jié)侵犯階段（曲線下面積=0.692），以及結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)階段（曲線下面積=0.699），這些都具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。此外，注意到相比于癌旁組織，在腫瘤組織中的SFRP2全部低甲基化（p<0.001）。值得注意的是，接受新輔助治療的結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)出較低的SFRP2甲基化水平，而在未經(jīng)治療的患者中，SFRP2的甲基化與較差的總生存有關(guān)。

結(jié)果 1

SFRP2啟動子的甲基化為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物

在本研究中，本文測量了全血和脂肪組織中SFRP2基因的表達(dá)和甲基化水平。如下圖所示，沒有發(fā)現(xiàn)健康者與結(jié)直腸癌患者之間在全血中SFRP2啟動子甲基化水平上有顯著差異。此外，沒有觀察到在全血中SFRP2甲基化或表達(dá)水平之間有任何顯著差異。當(dāng)觀察預(yù)后時，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌晚期患者的SFRP2甲基化水平比早期患者低（p=0.044），而且比健康參與者低（p=0.035），AUC為0.879（95% CI 0.700-0.942），這一差異在調(diào)整了臨床變量之后仍然顯著。結(jié)直腸癌患者如果有淋巴結(jié)侵犯，他們的SFRP2甲基化水平也會比那些沒有淋巴結(jié)侵犯的患者低（p=0.014），AUC為0.844（95% CI 0.736-0.951）。如果結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，他們的SFRP2甲基化水平也會比那些沒有復(fù)發(fā)的患者低（p=0.013），AUC為0.821（95% CI 0.700-0.942）。同時，還測量了脂肪組織中SFRP2基因的表達(dá)和甲基化水平。沒有發(fā)現(xiàn)健康參與者與結(jié)直腸癌患者之間在脂肪組織中SFRP2啟動子甲基化水平上有顯著差異。然而，結(jié)直腸癌患者有較低的SFRP2表達(dá)水平。此外，沒有觀察到在脂肪組織中SFRP2甲基化或表達(dá)水平之間有任何顯著差異。

結(jié)果 2

同一隊列的腫瘤組織中SFRP2基因的DNA甲基化作為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物

本文利用Infinium DNA甲基化450K數(shù)據(jù)評估了結(jié)直腸癌患者和健康志愿者的結(jié)腸組織中SFRP2基因的表達(dá)和甲基化情況。如下圖A所示，SFRP2基因的全面β甲基化在腫瘤區(qū)域高于非腫瘤區(qū)域（p<0.001）。不過，沒有發(fā)現(xiàn)兩個區(qū)域之間在SFRP2表達(dá)上的顯著差異（p=0.171）。如下圖C和F所示，SFRP2基因的全面β甲基化在腫瘤區(qū)域確實高于非腫瘤區(qū)域（p<0.001）。此外，本文還注意到SFRP2在腫瘤區(qū)域的表達(dá)通常低于非腫瘤區(qū)域（p<0.001）。最后，對結(jié)直腸癌腫瘤的單細(xì)胞RNA測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)在非腫瘤區(qū)的癌細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)相對較高，而在腫瘤核心和腫瘤邊界區(qū)的癌細(xì)胞中SFRP2的表達(dá)則較低。在細(xì)胞級別，本文看到SFRP2主要在非腫瘤區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)。

接下來，本文探討了可能影響結(jié)直腸癌患者中SFRP2啟動子甲基化的因素。為此，進行了一項調(diào)整了年齡、性別和體質(zhì)指數(shù)的線性回歸分析。發(fā)現(xiàn)腫瘤的位置（結(jié)腸或直腸）與SFRP2啟動子甲基化有關(guān)（p<0.05）。具體來說，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸中的SFRP2啟動子的甲基化程度高于直腸。此外，還發(fā)現(xiàn)接受過新輔助治療的結(jié)直腸癌患者與未接受過新輔助治療的患者相比，其SFRP2啟動子的甲基化程度更高。在Kaplan-Meier圖中，可以看到，與高甲基化狀態(tài)相比，低甲基化狀態(tài)的非治療結(jié)直腸癌患者的生存期更短。為了找出與SFRP2甲基化相關(guān)的其他因素，進行了一項邏輯回歸分析，并將SFRP2甲基化分為低和高兩個級別。發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸中的SFRP2甲基化更傾向于發(fā)生在那些沒有淋巴結(jié)浸潤的患者身上。而且，與未接受過新輔助治療的患者相比，那些接受過新輔助治療的患者其SFRP2甲基化程度更高。在早期（I+II階段）的結(jié)直腸癌患者中，我們可以看到，與高甲基化狀態(tài)相比，低甲基化狀態(tài)的患者的數(shù)量更多。

結(jié)果 3

SFRP2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移

最后，本文使用HCT116細(xì)胞模型研究了SFRP2，分析了這些細(xì)胞中SFRP2啟動子的甲基化情況。發(fā)現(xiàn)在HCT116中，SFRP2的啟動子在本文分析的7個CpG位點上都是完全甲基化的。這些位點的甲基化百分比分別是：93±3.7%（位點1）；89±2.5%（位點2）；97±2.5%（位點3）；99±1.5%（位點4）；92±4.3%（位點5）；98±2.5%（位點6）和97±3.6%（位點7）。然后，用AZA（一個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）來處理HCT116細(xì)胞，研究了這個完全甲基化的啟動子是否會影響SFRP2的表達(dá)。在AZA處理后，發(fā)現(xiàn)SFRP2的表達(dá)是可以恢復(fù)的，并且隨著1、5和10 µM AZA的增加而增加。因為SFRP2在HCT116中沒有表達(dá)，用重組人SFRP2（rhSFRP2）來處理這些細(xì)胞。在48小時的治療后，看到在0.1、0.5和1 µg/mL的rhSFRP2濃度下，細(xì)胞的存活率保持在100%。在2.5 µg/mL的rhSFRP2中，細(xì)胞的生存率下降到了81%，在5 µg/mL的rhSFRP2中，則進一步降低到了66%，這與對照組相比有顯著差異。隨后，本文評估了rhSFRP2在細(xì)胞遷移中的作用。在24小時的劃痕后，沒有觀察到rhSFRP2和對照組之間有任何遷移差異。但是在48小時后，發(fā)現(xiàn)在5 µg/mL的rhSFRP2中，細(xì)胞的遷移減少了。此外，還發(fā)現(xiàn)治療與rhSFRP2會導(dǎo)致AXIN2表達(dá)的降低。而在CTNNB1、TIAM1和VEGF基因中，沒有觀察到任何表達(dá)變化。

參考文獻(xiàn)

Boughanem H, Pilo J, García-Flores LA, Arranz I, Ramos-Fernandez M, Ortega-Castan M, Crujeiras AB, Sandoval J, Macias-Gonzalez M. Identification of epigenetic silencing of the SFRP2 gene in colorectal cancer as a clinical biomarker and molecular significance. J Transl Med. 2024 May 27;22(1):509. doi: 10.1186/s12967-024-05329-x. PMID: 38802858.